層析柱是凝膠層析技術中的主體，一般用玻璃管或有機玻璃管。根據樣品混合物中各組分在固定相和流動相中分配系數不同，從而分離的一種層析法。
層析柱的直徑大小不影響分離度，樣品用量大，可加大柱的直徑，一般制備用凝膠柱，直徑大于2厘米，但在加樣時應將樣品均勻分布于凝膠柱床面上。此外， 直徑加大，洗脫液體體積增大，樣品稀釋度大。分離度取決于柱高，為分離不同組分，凝膠柱床必須有適宜的高度，分離度與柱高的平方根相關，但由于軟凝膠柱過高擠壓變形阻塞，一般不超過1米。分族分離時用短柱，一般凝膠柱長20-30厘米，柱高與直徑的比較5:1─10:1，凝膠床體積為樣品溶液體積的4-10倍。 分級分離時柱高與直徑之線為20:1─100:1，常用凝膠柱有50×25厘米，10×25厘米。層析柱濾板下的死體積應盡可能的小，如果支掌濾板下的死體積大，被分離組分之間重新混合的可能性便大，其結果是影響洗脫峰形，出現拖尾出象，降低分辯力。在準確分離時，死體積不能超過總床體積的1/1000。